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張家界恒康生物藥業(yè)有限公司

核酸檢測用到的核心酶原料!

2022年3月以來,狡猾的奧密克戎變異毒株又一次打破了人們平靜的生活,全國各地陸續(xù)爆發(fā)新冠疫情,波及30個省(區(qū)、市)。核酸檢測作為疫情精準(zhǔn)防控的有效手段,儼然已成為一種生活常態(tài),“今天你核酸了嗎?  ”也轉(zhuǎn)變?yōu)槿藗兊娜粘柡蛘Z。  說到這,大家了解核酸檢測中需要用到哪些核心原料嗎?  本文就來介紹一下核酸檢測中最關(guān)鍵的核心原料-酶。  

核酸檢測流程

酶是一類極為重要的生物催化劑,具有催化高效性和反應(yīng)特異性。絕大多數(shù)生化反應(yīng)均需要酶的參與,核酸檢測也不例外。在新冠核酸檢測過程中(圖1所示),不同類型的分子酶在核酸檢測的不同實驗階段(核酸提取、RT-qPCR)發(fā)揮了重要的作用。 接下來,根據(jù)核酸檢測中的不同實驗環(huán)節(jié)為大家梳理核酸檢測過程中用到的核心酶原料。  

圖1.新冠核酸檢測流程

核酸提取過程中的核心酶

病毒核酸提取過程主要包括裂解和純化兩大步驟: 

 裂解  是破壞樣品細胞結(jié)構(gòu),從而使樣品中的核酸游離在裂解體系中的過程;  

純化  則是使核酸與裂解體系中的其它成分,如蛋白質(zhì)、鹽及其它雜質(zhì)徹底分離,反應(yīng)過程需要蛋白酶K(Proteinase K)、脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase I)及RNase抑制劑的參與。

蛋白酶K

蛋白酶K是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶,可切割脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵(圖2所示)。在核酸提取過程中,蛋白酶K可降解與核酸緊密結(jié)合的組蛋白,促進核酸的分離,使樣本核酸能更好的被提取。另外,蛋白酶K可降解RNA水解酶(RNase)活性,抑制RNase水解模板RNA。

圖2.蛋白酶K水解肽鍵示意圖

恒康生物蛋白酶K來源于基因重組酵母菌株,比活性≥30 U/mg蛋白,不含RNase和DNase,在尿素和SDS溶液中酶活性穩(wěn)定存在,在較廣的pH范圍內(nèi)(pH 4.0~12.0)均有活性,適用于原位雜交樣本制備,核酸純化等實驗中蛋白質(zhì)的切割清除。  

脫氧核糖核酸酶Ⅰ

脫氧核糖核酸酶I(Deoxyribonuclease I, DNase I)可催化多種形式DNA,靶向切割鄰近嘧啶的磷酸二酯鍵,產(chǎn)生5’端為磷酸基團、3’端為羥基的多聚核苷酸,平均消化產(chǎn)物最小為多聚四核苷酸。在新冠核酸提取過程中,DNase I主要用于除去RNA樣本中的基因組污染,避免RNA模板中存在DNA殘留,提高模板純度。 恒康生物DNase I來源于重組E. coli菌株,不含RNase,可以用于各種RNA樣品的處理,最佳的工作pH范圍是7-8。在Mg  2+  存在下,DNase I可隨機剪切雙鏈DNA的任意位點;而在Mn  2+  存在的條件下,DNase I可在同一位點剪切DNA雙鏈,形成平末端或有1-2個核苷酸突出的粘末端(圖3所示)。

圖3.DNase I在Mg2+以及Mn2+存在下可切割dsDNA原理圖

RNase抑制劑

在核酸檢測過程中,樣本核酸的提取、純化或?qū)嶒灥姆磻?yīng)體系配制的過程中,均有可能引入核糖核酸酶(RNase)的污染,導(dǎo)致RNA模板被降解。若要避免RNase的污染,則需要RNase 抑制劑(RNase Inhibitor)發(fā)揮作用。 RNase Inhibitor是人的胎盤中存在的一種特異性RNase抑制劑,能夠特異地與RNase以非共價鍵結(jié)合形成復(fù)合體從而使RNase失活。恒康生物鼠源RNase抑制劑Murine RNase Inhibitor(Cat#10603ES)不含人源蛋白中的兩個對氧化非常敏感的半胱氨酸,具有更高的抗氧化活性,能夠廣泛抑制各種類型RNase(RNase A, B, C),更加適合于對高二硫蘇糖醇(DTT)敏感性的實驗如qPCR反應(yīng)。

RT-qPCR過程中的核心酶

在完成樣本核酸提取后,可通過RT-qPCR來完成核酸的檢測。在這些實驗過程中,DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、尿嘧啶DNA糖基化酶都是必不可少的核心酶原料。

逆轉(zhuǎn)錄酶

提取純化后新冠病毒RNA,在進行qPCR反應(yīng)前需先通過逆轉(zhuǎn)錄酶催化dNTP聚合(即RT-Reverse Transcription,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)),生成與模板RNA互補的cDNA序列(圖4)。對于RT-qPCR反應(yīng),應(yīng)選擇可耐高溫的逆轉(zhuǎn)錄酶,目前市面上應(yīng)用最廣泛的為MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶,因其缺乏DNA內(nèi)切酶活性且RNase H活性較低,在cDNA克隆應(yīng)用中更有優(yōu)勢。  

圖4.逆轉(zhuǎn)錄過程示意圖   

恒康生物第五代耐熱逆轉(zhuǎn)錄酶(Cat#11300ES)是通過基因工程技術(shù)得到的全新逆轉(zhuǎn)錄酶,熱穩(wěn)定性好,可耐受高達60℃的反應(yīng)溫度,適合具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄。同時,該酶增強了與模板的親和力,適合少量模板以及低拷貝基因的逆轉(zhuǎn)錄,可擴增長達10 kb的cDNA。

DNA聚合酶

完成模板逆轉(zhuǎn)錄過程生成雙鏈cDNA以后,就需要PCR反應(yīng)中的“靈魂選手”DNA聚合酶閃亮登場,通過聚合游離的脫氧核糖核苷酸進行DNA鏈的延伸,在體外完成模板DNA的大量擴增,實現(xiàn)病毒核酸可被檢測的目的。 在RT-qPCR反應(yīng)中常用的DNA聚合酶為熱啟動Taq DNA聚合酶,該類酶在常溫條件下無活性,只有經(jīng)過熱啟動以后才具有聚合活性,可以最大限度地減少背景信號的生成,很好的解決了常規(guī)PCR反應(yīng)中引物二聚體產(chǎn)生或錯配引起的非特異性擴增等問題。目前市面上常用的DNA聚合酶熱啟動修飾方法主要有化學(xué)修飾、配體修飾和抗體修飾等,不同的熱啟動修飾方法原理如圖5所示。  

圖5.不同類型修飾熱啟動酶原理圖

恒康生物High Specific Taq DNA Polymerase, 5 U/μL(Cat#10726ES)是雙抗體進行雙封閉的熱啟動DNA聚合酶,具有高模板親和力。在常溫下不僅封閉了5'→3'聚合酶活性,同時也封閉了5'→3'核酸外切酶活性。在95℃條件下變性30sec其封閉抗體即可完全失活,釋放出DNA聚合酶活性和核酸外切酶活性。雙封閉特性不僅能有效防止錯配或引物二聚體引起的非特異性擴增,又能有效抑制探針降解產(chǎn)生的熒光信號下降,雙重保障使體外檢測試劑在運輸或室溫使用過程中更加穩(wěn)定。

尿嘧啶DNA糖基化酶

在核酸檢測過程中,操作環(huán)境中的氣溶膠污染是造成PCR結(jié)果假陽性最常見的因素,在擴增體系中加入UDG酶(Uracil DNA Glycosylase,尿嘧啶DNA糖基化酶)則可有效消除PCR體系中混入的擴增殘留污染物(多以氣溶膠形式存在),保證擴增結(jié)果的準(zhǔn)確性。UDG酶防污染原理如圖6所示。

圖6.UDG酶防污染原理示意圖

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